Dr. Rafael Picorel*, Dr. Miguel Alfonso, Dr. María Bernal, Dr. Sara López

M. Victoria Ramiro, Patricia Lorente,  Dr. María A. Luján, Mirén B. del Castillo, Beatriz Lagunas, Angela Román, Diana Sancho

* Responsable del Grupo

Objetivo General

La finalidad del Grupo es llevar a cabo un estudio multidisciplinar del cloroplasto utilizando tanto plantas de interés agronómico como soja o espinaca como plantas modelo como Arabidopsis thaliana en el que se combinan aspectos de estructura/función del aparato fotosintético y análisis de la respuesta del cloroplasto a determinados estreses abióticos. Para ello utilizamos fundamentalmente técnicas de bioquímica, biofísica, biología molecular, genómica, proteómica y bioinformática.

Objetivos específicos

1. Estructura y función del fotosistema II.

R. Picorel

picorel@eead.csic.es 

Con este objetivo pretendemos abordar algunos temas pendientes sobre la estructura y función del PSII y sistemas afines. Para conseguir dicho objetivo llevaremos a cabo las siguientes actuaciones:

• Estructura y función del citocromo b559. A pesar de conocerse desde hace mucho tiempo la existencia de este citocromo y después de un intenso trabajo, su función es aún desconocida. Se sabe que está íntimamente asociado al PSII formando un supercomplejo y su función podría estar relacionada con sus propiedades redox únicas. Este citocromo está constituido por dos subunidades proteicas, _ y _, codificadas por los genes cloroplásticos psbE y psbF, respectivamente. Hemos clonado y sobreexpresado estos genes de remolacha en E. coli y purificado los péptidos recombinantes. Mezclando las subunidades proteicas purificadas y el grupo hemo comercial, hemos conseguido la reconstitución in vitro de esta cromoproteína. La calidad de la reconstitución se determinará mediante técnicas espectroscópicas (principalmente UV-VIS y EPR) y potenciométricas. A continuación repetiremos el mismo proceso con mutantes dirigidos en el entorno hemo y analizaremos las propiedades redox de cada uno de ellos para determinar los aminoácidos responsables de las propiedades redox únicas de este citocromo. Además, sobreexpresando en E. coli el gen psbF de la cianobacteria Synecchocystis, hemos conseguido la reconstitución del citocromo en la membrana citoplasmática de la bacteria. Parte de este trabajo lo realizamos en colaboración con los Drs. Pablo J. Alonso/Jesús I. Martínez del grupo de espectroscopia de EPR del ICMA-CSIC-Universidad de Zaragoza, Zaragoza y los Drs. José M. Ortega/Mercedes Roncel del IBVF-Universidad de Sevilla-CSIC, Sevilla.
• Propiedades espectrales del centro de reacción. Todos los pigmentos del centro de reacción del PSII absorben en un rango de frecuencias muy estrecho en la región espectral del rojo, dificultando enormemente su caracterización espectroscópica. Trabajos anteriores de nuestro Grupo permiten pronosticar que mediante tratamientos controlados con detergentes específicos podremos destruir selectivamente algunas bandas de absorción, facilitando, así, la caracterización de las restantes. Tratamientos controlados con el detergente Triton X-100 dieron lugar a la desaparición selectiva de la banda con máximo de absorción a 684 nm y reducción de la banda de absorción a 678 nm. Concomitante con ello, se observó un aumento de la absorción a 670 nm y la aparición de una banda de fluorescencia a 671 nm, ambas características de clorofila monomérica (el máximo de fluorescencia del centro de reacción purificado es cercano a 683 nm). No se observaron bandas de fluorescencia intermedias, demostrando así que los pigmentos pasan directamente de su estructura nativa a una estructura monomérica sin estados intermedios por efecto del detergente.
• Estructura y función de las antenas internas CP43 y CP47. Utilizando preparaciones con un alto grado de pureza y técnicas espectroscópicas de alta resolución como “hole burning” y “line-narrowing fluorescence” además de modelización molecular, estamos abordando la caracterización espectroscópica y determinación de los sitios de fotoconversión de energía de estos complejos de pigmentos-proteína. Dichos estudios han sido ampliados recientemente al complejo CP43´. Este complejo está formado normalmente por 18 copias del producto del gen IsiA de cianobacterias, que se induce en condiciones de deficiencia de Fe y otros estreses medioambientales) y se ubica rodeando el “core” del PSI. Estamos caracterizando el supercomplejo PSI-CP43´ y el complejo CP43´ con alta pureza. Este trabajo lo estamos llevando a cabo en colaboración con el Dr. Michael Seibert (NREL-DOE, Golden CO) y el Prof. Ryszard Jankowiak (Kansas State University, Manhattan KS).
• Estudio de centros paramagnéticos del PSII. Quizás el tema que está teniendo actualmente mayor relevancia en fotosíntesis natural es la elucidación del mecanismo de oxidación fotosintética del H2O. En este proceso se generan protones, electrones y oxígeno molecular. Aplicando técnicas avanzadas de EPR hemos iniciado la caracterización de los radicales que se forman durante este proceso y su interacción con el entorno. Los resultados se interpretarán teniendo en cuenta la estructura tridimensional del PSII, resuelta recientemente a 3 _, y podrán ser utilizados asimismo en proyectos de fotosíntesis artificial para la producción biológica de H2 y otros compuestos de alto valor añadido. Este trabajo lo estamos realizando en colaboración con los Drs. Pablo J. Alonso/Jesús I. Martínez del grupo de espectroscopia de EPR del ICMA-CSIC-Universidad de Zaragoza, Zaragoza.

2.  Homeostasis del cobre en plantas.

R. Picorel

picorel@eead.csic.es

El cobre es un microelemento esencial para los organismos vivos ya que interviene como cofactor de muchos enzimas y proteínas de procesos fundamentales. Pero también puede ser muy tóxico si se encuentra como ión libre ya que cataliza la formación de ROS a través de las reacciones de Haber-Weiss y Fenton. Por lo tanto, es muy importante para la célula controlar la homeostasis de este metal pesado. Estamos llevando a cabo las siguientes actuaciones:

• Respuestas adaptativas de suspensiones celulares fotosintéticas de soja a altas concentraciones de Cu2+. Trabajos recientes de nuestro grupo han demostrado que la presencia de altas concentraciones de Cu2+ en el medio de cultivo de suspensiones celulares fotosintéticas de soja estimulan la formación del aparato fotosintético, especialmente del grana, y la fotosíntesis sin un aumento significativo de los enzimas antioxidantes. Sin embargo, las células acumulan altas concentraciones de Cu en su interior, principalmente en el cloroplasto, como se determinó por microscopia de fluorescencia de Rayos X. Altas concentraciones de este metal inducen también modificaciones morfológicas subcelulares muy significativas.
• Transporte de cobre en el cloroplasto. Recientemente hemos abordado la clonación en E. coli del gen HMA8 de soja (GmHMA8) que codifica para un transportador de cobre ubicado en la membrana tilacoidal tal como hemos determinado mediante técnicas de inmunodetección con un Ab específico desarrollado contra un péptido sintético de esta proteína. Este transportador de unos 95 kDa liberaría cobre al lumen en donde se uniría presumiblemente a las apo--plastocianina y apo-polifenoloxidasa. Debido al tamaño del gen, hemos clonado y secuenciado el gen por partes y obtenido finalmente la secuencia completa aunque no hemos podido clonar el gen completo. Hemos analizado la estructura del gen y hemos visto que se regula por un mecanismo de “splicing” alternativo y también por concentraciones de cobre. Por otro lado, hemos identificado un gen divergente de GmHMA8 que hemos denominado GmHMA8-T y que también se encuentra regulado por “splicing” alternativo. Estudiaremos los diferentes productos que se generan por ese mecanismo y sus posibles funciones.
• Caracterización de la chaperona CCS del cloroplasto de soja. Mediante trabajos in silico hemos detectado un gen en soja homólogo al de la CCS de levadura y humano. La CCS es una chaperona de cobre que transporta y cede este ión de manera específica y precisa a la Cu/ZnSOD para formar el holoenzima funcional. En plantas se encuentra tanto en el citosol como en el cloroplasto. Recientemente, hemos clonado, sobreexpresado este gen de soja en E. coli y purificado la proteína recombinante. Estamos en proceso de analizar la proteína obtenida. También estudiaremos la regulación del gen y de su proteína producto en diversas condiciones de cobre.
• Proteoma del cloroplasto. Próximamente iniciaremos trabajos de proteómica del cloroplasto en condiciones variables de cobre (exceso y deficiencia) mediante técnicas de electroforesis 2-D y HPLC-MS. Con ello pretendemos analizar de una forma más global el proteoma del cloroplasto directa o indirectamente relacionado con la homeostasis del ión cobre.

3.  Desaturasas de ácidos grasos.

M. Alfonso, R. Picorel

alfonso@eead.csic.es 

Las desaturasas de ácidos grasos son enzimas clave en el metabolismo lipídico, ya que introducen dobles enlaces en los ácidos grasos, constituyentes de los lípidos. Este grado de insaturación determina, en gran medida, las propiedades fisico-químicas de las membranas biológicas y tiene una influencia directa sobre su funcionamiento y, por tanto, en la fisiología de la planta. La manipulación genética de estos enzimas ha sido un objetivo prioritario tanto de biotecnólogos como de mejoradores en un intento de obtener plantas mejor adaptadas a algunos estreses medioambientales, como el frío, u obtener aceites vegetales más saludables para el consumo humano o más eficaces para su uso industrial. Sin embargo, la mayoría de estos proyectos no han obtenido los resultados esperados, debido fundamentalmente al desconocimiento que, a día de hoy, tenemos de los mecanismos de regulación de las desaturasas de plantas y los diferentes elementos implicados en su control. Así, nuestro principal objetivo es estudiar dichos mecanismos de regulación y el papel que determinados factores tanto genéticos como medioambientales ejercen sobre dicha regulación. Éste objetivo específico se desarrolla mediante las siguientes actuaciones:

• Estudio de los mecanismos de regulación de las desaturasas de soja. En los últimos años, utilizando suspensiones celulares de soja como sistema modelo, hemos estudiado los mecanismos de regulación de las desaturasas en respuesta a determinados factores medioambientales. Nuestros resultados han puesto en evidencia un mecanismo de regulación por la luz complejo. Así, mientras las omega-3 desaturasas FAD3 o FAD8 parecen estar reguladas por luz a nivel transcripcional, la desaturasa FAD7 estaría controlada a través de un mecanismo pos-transcripcional donde el transporte electrónico fotosintético controla la estabilidad del mRNA FAD7. Recientemente hemos obtenido un Ab policlonal contra la proteína GmFAD7 que nos ha proporcionado datos muy interesantes acerca de la localización subcelular preferente de esta proteína en la membrana tilacoidal. Este Ab nos ha permitido estudiar la acumulación y la estabilidad de la proteína GmFAD7 en diferentes condiciones medioambientales. Los datos indican que la proteína FAD7 parece ser intrínsecamente estable (su estabilidad no depende de la temperatura ni de la luz), lo que necesariamente implicaría la existencia de un mecanismo aún desconocido de regulación pos-traduccional que permitiría la activación/inactivación de la enzima. Pretendemos ahondar nuestro conocimiento de los mecanismos de regulación de las desaturasas de soja utilizando plantas crecidas en condiciones controladas. Analizaremos el efecto de diversos factores (luz, temperatura, desarrollo de la planta), complementando así los resultados obtenidos en suspensiones celulares. Una de las tareas fundamentales es demostrar experimentalmente la más que probable existencia de diferentes isoformas de GmFAD7. Utilizando tanto técnicas moleculares como 2D/MALDI, intentaremos identificar la expresión y patrón de acumulación de estas isoformas y analizar su contribución relativa a la síntesis de ácidos grasos trienoicos. Con la ayuda de las técnicas de 2D/MALDI también pretendemos identificar elementos de control implicados en la regulación pos-traduccional de la proteína GmFAD7. También estamos interesados en estudiar la comunicación entre el retículo y el cloroplasto para la producción de ácidos grasos poliinsaturados y el control de la insaturación de los lípidos de membrana.
• Genómica funcional de la ruta de instauración de ácidos grasos de plantas. Actualmente, estamos utilizando herramientas genómicas para detectar alteraciones en el transcriptoma de plantas mutantes de Arabidopsis deficientes en la insaturación de ácidos grasos. Uno de los objetivos fundamentales del proyecto es aportar evidencias experimentales de cómo la manipulación de la ruta de desaturación de ácidos grasos produce una serie de efectos pleiotrópicos no deseados que afectan a la fisiología de la planta y que, en principio, no están directamente relacionados con la desaturación de ácidos grasos. Estamos obteniendo, así, información relevante sobre la interacción del metabolismo de los ácidos grasos con otras rutas metabólicas. También obtenemos información relativa a los mecanismos de compensación que establece la planta en respuesta a la eliminación de una desaturasa específica.
• Papel de la insaturación de ácidos grasos de los lípidos de membrana en el ensamblaje del PSII. Recientemente hemos publicado resultados que demuestran la estrecha relación entre la insaturación de ácidos grasos, fluidez de la membrana tilacoidal y capacidad de ensamblaje de novo del supercomplejo del PSII una vez fotoinhibido. Se propone avanzar en este estudio mediante la utilización de mutantes de Arabidopsis deficientes en algunas desaturasas.

Publicaciones más representativas 

Publicaciones SCI:

• Bernal M, Testillano PS, Alfonso M, Risueño MC, Picorel R and Yruela I. Identification and subcellular localization of the soybean copper P1B-ATPase GmHMA8 transporter. J Structural Biology (2007) 158: 46-58.
• Bernal M, Cases R, Picorel R and Yruela I. Foliar and root Cu supply affect differently Fe and Zn uptake and photosynthetic activity in soybean plants. Environm and Experim Botany (2007) 60: 145-150.
• Roncel M, Yruela I, Kirilovsky D, Guerrero F, Alfonso M, Picorel R and Ortega JM. Photosynthetic electrón transfer and state transition changes in a herbicide-resistant D1 mutant from soybean cell cultures. Biochim Biophys Acta-Bioenergetics (2007) 1767: 694-702.
• Andreeva A, Abarova S, Stoitchkova K, Picorel R and Velitchkova M. Selective photobleaching of chlorophylls and carotenoids in Photosystem I particles under high-light treatment. Photochem and Photobiol (2007) 83: 1-7.
• Andreu V, Collados R, Testillano PJ, Risueño MC, Picorel R and Alfonso M. In situ molecular identification of the plastid ?3 fatty-acid desaturase FAD7 from soybean: Evidence of thylakoid membrane localization. Plant Physiol (2007) 145: 1336-1344.
• Dang NC, Zazubovich V, Reppert M, Neupane B, Picorel R, Seibert M and Jankowiak R.The CP43 proximal antenna complex of higher plant Photosystem II revisited: Modeling and hole burning study. J Phys Chem B (2008) 112: 9921-9933.
• Neupane B, Dang NC, Acharya K, Reppert M, Zazubovich V, Picorel R, Seibert M and Jankowiak R.New insight into the electronic structure of the CP47 antenna protein Part I: Hole-burning and fluorescence study . J Am Chem Soc (2010) 132: 4214-4229.
• Andreu V, Lagunas B, Collados R, Picorel R and Alfonso M. The GmFAD7 gene family from soybean: Identification of novel genes and tissue-specific conformations of the FAD7 enzyme envolved in desaturase activity. J Exp Botany (2010) 61: 3371-3384.
• Martinez J, Yruela I, Picorel R and Alonso P. 1H hyperfine interactions in the Mn-cluster of Photosystem II in the S2 state detected by hyperfine sublevel correlation spectroscopy. J Phys Chem B (2010) 114: 15345-15353.
• Chodavarapu RK, Feng S, Bernatavichute YV, Chen PY, Stroud H, Yu Y, Hetzel JA, Kuo F, Kim J, Cokus SJ, Casero D, Bernal M, Huijer P, Clark AT, Krämer U, Merchant SS, Zhang X, Jacobsen SE, Pellegrini M. Relationship between nucleosome positioning and DNA methylation. Nature (2010) 466: 388-392.
• Sagasti S, Yruela I, Bernal M, Lujan MA, Frago S, Medina M and Picorel R. The Copper Chaperone for the Copper/Zinc Superoxide Dismutase (CCS) from Glycine max. Metallomics (2011) 3: 169-175.
• Herascu N,Najafi M, Amunts A, Pieper J, Irrgang K.-D., Picorel R, Seibert M, Nelson N and  Zazubovich V. Parameters of the protein energy landscapes of several hole growth kinetics. J Phys Chem B (2011) 115: 2737-2747.
• Ximao Feng, Bhanu Neupane, Khem Acharya, Valter Zazubovich, Rafael Picorel, Michael Seibert and Ryszard Jankowiak. Spectroscocpic study of CP43´complex and PSI-CP43´supercomplex of the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. J Phys Chem B (2011) 115: 13339-13349.
• Nicoleta Herascu, Somaya Ahmouda, Rafael Picorel, Michael Seibert and Valter Zazubovich. Effects of the distributions of energy or charge transfer rates on spectral hole burning in pigment-protein complexes at low temperatures. J Phys Chem B (2011) 115: 15098-15109.
• Bernal M, Casero D, Singh V, Wilson GT, Grande A, Yang H, Dodani SC, Pellegrini M, Huijer P, Connolly EL, Merchant SS, Krämer U. Transcriptome sequencing identifies SPL7-required Cu acquisition genes FRO4/FRO5 and the Cu dependence of the Fe homeostasis in Arabidopsis. The Plant Cell (2012) 10.1105/tpc.111.090431.
• María A. Luján, Jesús I. Martínez, Pablo J. Alonso, Fernando Guerrero, Mercedes Roncel, José M. Ortega, Inmaculada Yruela and Rafael Picorel. Reconstitution, spectroscopy and redox properties of the photosynthetic recombinant b559 from higher plants. Phochem Photobiol Sci, 1st revision.
• Khem Acharya, Bhanu Neupane, Valter Zazubovich, Richard T. Sayre, Rafael Picorel, Michael Seibert and Ryszard Jankowiak.  Site-Energies of Active and Inactive Pheophytins in the Reaction Center of Photosystem II from Chlamydomonas reinhardtii. J Phys Chem B, submitted.
• Sara Sagasti, María Bernal, Diana Sancho, del Castillo Maria B. and Rafael Picorel. Regulation of the chloroplastic copper chaperone (CCS) for the copper/zinc superoxide dismutase (Cu/ZnSOD) in copper excess conditions. In preparation.
• Angela Román, Vanesa Andreu, Luisa Hernández, Beatriz Lagunas, Rafael Picorel, José Manuel Martínez-Rivas and Miguel Alfonso. Contribution of the different omega-3 fatty acid desaturases to the modifications of glycerolipid fatty acid composition in response to cold in soybean. J Exp Bot, under revision.

Capítulos de libros:

• Michael Seibert and Rafael Picorel.Isolation of photosystem II reaction center complexes from plants (2010). In Methods in Molecular Biology: Photosynthesis Research Protocols 2nd Edition (R. Carpentier, Ed.) pp. 17-27. Humana Press.
• Rafael Picorel, Miguel Alfonso and Michael Seibert.Isolation and purification of CP43 and CP47 photosystem II proximal antenna complexes from plants (2010). In Methods in Molecular Biology: Photosyntesis Research Protocols 2nd Edition (R. Carpentier, Ed.) pp. 105-112. Humana Press

Proyectos y contratos de investigación en vigor

• Estructura, función y regulación de genes y proteínas cloroplásticas: fotosistemas, transportadores de cobre y desaturasas de ácidos grasos. PN I+D+i (AGL2008-00377), en evaluación. Responsable: R. Picorel.
• Mecanismos moleculares de tolerancia e hiperacumulación de metales en plantas hiperacumuladoras. Entidad financiadora: Ibercaja-ARAID (DGA). Responsable: M. Bernal.
• Estructura y función de genes y proteínas de plantas. Grupo Consolidado (Ref. 33) CONSI+D-DGA. Responsable: R. Picorel.